结核病实验室诊断技术介绍
时间:2012-08-13
4. 2利福平耐药核酸扩增检测方法（Xpert MTB/RIF）
1．结核分枝杆菌鉴定方法
1. 1萋尼氏抗酸染色痰涂片显微镜检查
目前萋尼氏抗酸染色痰涂片显微镜检查是我国结核病实验室使用最为普遍的方法，其操作简单快捷，特异性高，设备要求低，但是灵敏度较低，不能及时发现病人。
1.2 发光二极管荧光显微镜（LED荧光显微镜）
发光二极管荧光显微镜管利用二极管光源，延长了显微镜使用寿命，不需要暗室，且价格低廉，可以提高涂片的阳性检出率。目前在国内应用评估结果显示灵敏度较明场显微镜明显提高，已在部分区县开始使用。
1.3 交叉引物恒温扩增结核病诊断技术
在恒定温度下，特殊的引物和特异性探针在酶的作用下，反应体系在一个密闭的反应管内反应。扩增反应一般不超过一个小时，最短半小时。目前应用玻璃化试剂，稳定性好，便于运输。目前在国内区县级应用评估。
1.4 夹层杯结核病诊断方法
将痰标本（或其它标本）用专用消化灭活液充分消化，完全暴露并保留抗酸杆菌，通过自动离心涂片机（或半自动制片染色机）对消化后的标本进行充分集菌。直接在夹层杯装置中进行抗酸染色，取出基片或膜片置于普通显微镜进行观察。
夹层杯法操作方便快捷，便于标准化操作，通过消化灭活，安全性改善，阳性检出率也比直接涂片法大大提高。
夹层杯的装置有沉降式和虑过式，适用于不同工作量的医疗机构。
1.5 环介导等温扩增
方法采用2对引物在等温条件下即可完成DNA的扩增，扩增结果通过肉眼观察荧光进行判定，诊断是否为结核病。同时整个反应体系采用封闭系统减少了工作区域扩增子的污染，整个反应过程只需一个小时即可完成，通过肉眼观察荧光判读结果。
2．结核分枝杆菌培养方法
2.1 固体培养
培养是结核病诊断的精标准，也是获得分离菌株开展耐药检测的前提，我国结核病实验室最常用的是固体罗氏培养法，包括简单法和中和离心法。
虽然培养是诊断的精标准，但是花费时间长，需要4-8周时间。
2.2 液体培养
液体培养通过添加生长刺激剂，改变检测方法提高检测灵敏度等方式缩短了阳性报告时间。
目前应用的有BACTEC-快培、MGIT-快培和Alert 3D-快培法，虽然快速液体培养法缩短了报告时间，但是其价格昂贵且污染率高，限制了其广泛应用。目前国内应用主要集中在结核病专科医院。
3．药物敏感性试验
3.1 固体药物敏感性试验
药物敏感性试验是耐药结核病诊断的主要依据，在规范化治疗治疗中起着重要作用，不仅有助于筛选有效的抗结核药物，还可以了解耐药菌株的流行情况，为抗结核药物的合理应用提供实验依据。
目前我们国家结核病实验室使用的药敏方法有直接法和间接法，间接法最常用的方法有绝对浓度法药敏试验和比例法药敏试验。
绝对浓度发药敏试验时60年代以来结核病实验室特别是医院的实验室用于结核分枝杆菌药敏试验的常用方法，其原理是接种同一浓度的菌液在两支不同浓度的含药中性改良罗氏培养基上，计数对照培养基和含药培养基上细菌生长菌落的数量，根据含药培养基上菌落生长的数量，确定测试菌株对该药的耐药性。
比例法药敏试验是1996年世界卫生组织在我国开展耐药监测以来广泛在结核病实验室用于耐药性检测的方法。其原理是接种两种不同浓度的菌液在两支同一浓度的含药中性改良罗氏培养基上，计数对照培养基和含药培养基上细菌生长菌落的数量，计算耐药百分比，确定测试菌株对该药的耐药性。
无论是比例法还是绝对浓度法，都需要1个月时间报告药敏结果。
3.2 液体药物敏感性试验
液体药物敏感性试验通过对细菌培养代谢产物的检测，提高了检测灵敏度，缩短了报告时间。常用的BACTEC系统和MGIT系统，一般在结核病专科医院应用。
快速培养均利用液体培养基，通过检测仪器来完成药敏试验，但所用仪器价格昂贵，需进口使用厂家的专利液体培养基，费用较高，且方法仍然建立在以细菌培养的基础之上，都要通过分枝杆菌的自然生长以积累菌量方能检出。而分枝杆菌的生长相对缓慢，因而采用上述方法进行药敏试验都难以突破“慢”的限制。
3.3 最低抑菌浓度（MIC）测定
通过测定MIC，还可以分析菌株的耐药程度与耐药相关基因的突变的关系，为揭示耐药产生的机制提供信息。
4．分子生物学耐药检测方法
4. 1线性探针耐多药检测方法（LPA）
运用多重PCR扩增和反向杂交技术，通过检测RIF和INH耐药相关基因rpoB、KatG、inhA的突变，可以在1天内诊断结核分枝杆菌对RIF和INH的耐药性。
4. 2利福平耐药核酸扩增检测方法（Xpert MTB/RIF）
Xpert核酸扩增检测系统将样品准备、定量PCR扩增和荧光检测集于一身的核酸检测分析系统。使用者只需要在独立的反应孔中加入待检测的生物样品，两个小时内便能快速检测出患者是否结核以及对利福平是否耐药。
4. 3 基因芯片耐多药检测方法（GeneChip）
基因芯片耐多药检测方法是一种可以快速检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药性的分子生物学方法，它通过基于对利福平耐药基因rpoB及异烟肼耐药基因inhA和katG的扩增，将扩增产物与芯片上预先点制的探针进行杂交，以判断耐药基因的常见突变位点的突变情况，此外通过扩增16S rRNA进行菌种鉴定。
5．基因分型方法
5.1 MIRU基因分型方法
MIRU分型法是高等真核生物的基因分型中一种极有价值的研究方法。这种方法基于所谓多态性的微卫星或小卫星区域中重复序列的数量,提供一种简单、准确的分型手段，是实验室常用的基因方法之一。
将基因组DNA分离，以每个位点的引物进行PCR扩增（包括H37Rv标准对照和空白对照）， 扩增产物用凝胶电泳或毛细管电泳分离，根据扩增片断的大小确定每一位点重复数目。
MIRU结果报告为数字，每个数字对应于按标准顺序列出的、不同MIRU位点对应的重复数。在极少的情况下，重复数会大于9。为避免使用两位数，在报告结果中采用以下表示法：10次重复=“a”；11次重复=“b”；12次重复=“c”；等等。偶尔地，重复数为0。
MIRU 分辨率高， 与IS6110-RFL P 分型法结果高度相关。快速、适合于所有结核菌分离株,包括IS6110 拷贝数少的菌株,便于不同实验室结果比较。
5.2 spoligotyping 基因分型方法
Spoligotyping 是基于结核分枝杆菌基因组中直接重复区(DR)的多态性的分型方法。
基因组DNA分离，PCR方法扩增，包括阳性（H37Rv、BCG）和空白对照，扩增产物与固定在膜上的探针杂交，通过化学发光检测。
优点是简单、快速、适合临床标本，无需培养，结果数字化，便于比较。缺点是 分辨率低，尤其对于北京基因型菌株。
6．免疫学诊断技术
免疫学诊断技术是结核病细菌学诊断的重要补充，特别是对菌阴肺结核和肺外结核病患者。
TB-SA抗体检测法采用结核特异性抗原，TB-SA抗原具有极高的特异性，只存在于结核分枝杆菌和与其紧密相关的同类致病菌中。TB-SA基因的表达，只有在结核杆菌侵入人体巨噬细胞内才发生，排除接种卡介苗的人群对实验结果的影响，有效控制假阳性。TB-SA抗原蛋白是一种分泌性蛋白，容易被机体识别并引起免疫应答从而产生特异性抗体，在国内应用显示灵敏度可以达到80%以上。